Une lignée de souris clonées s’éteint après 58 générations, à mesure que s’accumulent des altérations génétiques délétères

Une expérience de 20 ans atteint ses limites

Après 30 947 tentatives de transfert nucléaire et plus de 1 200 souris clonées successivement à partir d’une seule femelle, une équipe de recherche japonaise a mis fin à une expérience qui a duré environ 20 ans. Les cinq souris nées à la 58e génération sont toutes mortes le lendemain, mettant un terme à une lignée que les chercheurs pensaient autrefois pouvoir prolonger indéfiniment.

Menée de 2005 à 2025, l’expérience a montré que les clonages répétés entraînaient une accumulation de mutations délétères dans l’ADN. Le taux de réussite des naissances s’est d’abord amélioré, passant d’environ 7 % à la première génération à 15,5 % à la 26e. Il a commencé à baisser à partir de la 27e génération, pour atteindre finalement 0,6 %, soit environ six naissances pour 1 000 embryons clonés transférés à des mères porteuses.

Les résultats sont présentés dans l’article Limitations of serial cloning, publié dans Nature Communications. L’université de Yamanashi a cité la professeure associée Sayaka Wakayama et le professeur Teruhiko Wakayama, directeur de son centre de biotechnologie avancée, parmi les chercheurs, dans son communiqué sur l’étude.

Le résultat le plus révélateur tient au contraste entre l’apparence des souris et leur capacité à se reproduire. Nombre d’entre elles semblaient en bonne santé et vivaient environ deux ans, mais les générations suivantes sont devenues de plus en plus difficiles à reproduire, par clonage comme par accouplement ordinaire.

Teruhiko Wakayama, pionnier du clonage de souris à l’université de Yamanashi, a expliqué la question à l’origine de l’expérience à l’aide d’une comparaison familière :

« Copier une image avec un photocopieur entraîne une légère perte de qualité. La qualité baisse encore davantage si l’on photocopie cette copie »,

Chez les souris, les changements concernaient à la fois des lettres de l’ADN et des segments beaucoup plus importants de chromosomes. L’étude établit un lien entre l’accumulation de ces mutations et l’effondrement final du taux de naissances réussies.

Comment les chercheurs ont cloné un clone

L’équipe a eu recours au transfert nucléaire de cellules somatiques. Une cellule somatique est une cellule du corps, par opposition à un ovule ou à un spermatozoïde. Les chercheurs en ont retiré le noyau, qui contient la majeure partie des instructions génétiques de la cellule, puis l’ont transféré dans un ovule non fécondé dont le propre noyau avait été retiré.

L’ovule devait ensuite reprogrammer ces instructions afin qu’un noyau provenant d’une cellule adulte puisse diriger le développement d’un embryon. Les chercheurs ont transféré les embryons obtenus dans des mères porteuses et utilisé des cellules des clones ayant survécu pour créer la génération suivante.

Les cellules donneuses provenaient de cellules du cumulus, qui entourent et soutiennent les ovules. La donneuse initiale était une souris dont le pelage agouti présente une coloration due à des bandes de pigments le long de chaque poil. Toutes les souris clonées étaient des femelles et avaient cette même couleur de pelage.

Les chercheurs produisaient environ trois à quatre générations par an. Au lieu de créer chaque souris directement à partir des cellules conservées de la donneuse initiale, ils ont transmis la lignée à plusieurs reprises par l’intermédiaire d’un nouvel animal cloné. Cette méthode leur a permis de suivre les mutations transmises d’une génération à la suivante.

Pourquoi les premiers résultats étaient prometteurs

Le communiqué de RIKEN de mars 2013 décrivait une expérience qui évoluait encore dans un sens encourageant. À la date de soumission de l’article, l’équipe avait produit 581 souris sur 25 générations, et 598 souris sur 26 générations au moment du communiqué.

Les chercheurs avaient utilisé la trichostatine A, ou TSA, un médicament qui aide le noyau transféré à réinitialiser l’activité de ses gènes. Les tentatives précédentes de clonage répété de souris n’avaient pas dépassé environ six générations. Grâce à la TSA et à l’amélioration des conditions expérimentales, le taux de réussite des naissances avait augmenté au lieu de baisser régulièrement.

À ce stade, les mesures de la santé, de la fertilité, de la durée de vie et des extrémités des chromosomes semblaient également rassurantes. Les chercheurs pensaient donc que le processus pourrait se poursuivre indéfiniment. Le suivi de la même lignée pendant dix années supplémentaires a révélé des problèmes qui n’étaient pas apparents au cours des 25 premières générations.

Les principales étapes montrent l’évolution des conclusions :

• 2005 : début du clonage en série. L’article final situe le début en janvier, tandis que le compte rendu de RIKEN de 2013 le place vers la fin de l’année.
• 8 mars 2013 : RIKEN annonce 598 souris sur 26 générations, avec un taux de réussite des naissances d’environ 15 %.
• À partir de la 27e génération : le taux de réussite des naissances amorce une baisse durable, malgré des variations d’une génération à l’autre.
• 2025 : l’expérience s’achève à la 58e génération, après la mort, le lendemain de leur naissance, des cinq souris de cette génération.

Qu’est-ce qui a changé dans l’ADN ?

Le séquençage du génome a révélé environ 3 700 variants mononucléotidiques et 80 petites insertions ou délétions entre la première et la 57e génération. Un variant mononucléotidique, ou SNV, est une modification d’une seule lettre de la séquence d’ADN. Une insertion ou une délétion ajoute ou retire un petit segment de cette séquence.

L’article estime la moyenne à 69,4 SNV et 1,4 petite insertion ou délétion par génération. De nombreuses mutations de l’ADN ont peu d’effet, mais certaines perturbent les instructions nécessaires au développement normal ou à la reproduction.

À titre de comparaison, les chercheurs ont étudié deux lignées de souris maintenues pendant 60 générations par accouplement entre frères et sœurs, sur une période d’environ 20 ans. Ces lignées ont accumulé en moyenne 22,3 SNV par génération. Le taux de la lignée clonée était donc environ 3,1 fois supérieur, si l’on compare 69,4 à 22,3.

La proportion de petites mutations prédites comme susceptibles de perturber ou de modifier les protéines a également augmenté. Elle est passée de 0,52 % pour les mutations apparues entre la première et la 23e génération à 1,19 % pour celles apparues entre la 23e et la 57e.

Les chercheurs ont également reconstitué l’arbre généalogique des souris à partir de leur ADN. Il correspondait à la lignée expérimentale consignée, confirmant que la chaîne descendait bien de la donneuse initiale tout au long de l’expérience.

Des mutations chromosomiques plus importantes ont alourdi le bilan

Les souris n’ont pas seulement accumulé des mutations touchant des lettres isolées de l’ADN. Le séquençage a mis en évidence environ 80 à 84 nouveaux variants structurels entre la première et la 57e génération, c’est-à-dire des altérations plus importantes de l’organisation ou de la quantité d’ADN.

Seize variants de grande ampleur concernaient des segments d’au moins 40 000 lettres d’ADN. Parmi les mutations figuraient la perte d’un chromosome X, une importante altération du chromosome 4 et un échange de matériel entre les chromosomes 7 et 9.

À la 57e génération, les chercheurs estimaient qu’environ 30 mutations entraînaient une perte de fonction génétique et qu’environ 50 modifiaient les instructions relatives aux protéines codées par les gènes, sans même compter la perte d’un chromosome X. Deux grandes délétions touchaient également la même région et supprimaient la fonction des deux copies d’un gène appelé Csmd1.

Les auteurs relient la baisse du taux de naissances à l’effet cumulé des mutations. Selon leur explication, de nouvelles mutations délétères apparues vers la fin de l’expérience ont fait dépasser à un génome déjà fortement altéré le seuil de tolérance des souris en développement.

L’origine du taux de mutation plus élevé n’est pas encore élucidée. Les transferts répétés de noyaux de cellules somatiques pourraient y contribuer, et les cellules du corps peuvent accumuler des mutations au cours de la vie d’un animal. L’absence de reproduction sexuée ordinaire modifie également la transmission de ces mutations d’une génération à l’autre.

Pourquoi la réinitialisation de l’activité des gènes n’a pas suffi

Le clonage ne consiste pas seulement à transférer de l’ADN dans un ovule. L’ovule doit aussi réinitialiser les marques chimiques qui contribuent à déterminer quels gènes sont actifs. Ces marques sont dites épigénétiques, car elles régulent l’utilisation de l’ADN sans en modifier la séquence.

Les chercheurs avaient envisagé que des échecs de ce processus de réinitialisation puissent s’aggraver à chaque cycle de clonage. Leurs mesures ont plutôt désigné l’accumulation de mutations de l’ADN comme principale explication de la baisse observée par la suite.

Les souris clonées avaient des placentas hypertrophiés, une caractéristique connue du clonage chez la souris. Pendant l’expérience, les placentas pesaient en moyenne environ 0,30 gramme, contre 0,11 gramme chez les témoins issus d’une fécondation in vitro. Leur poids n’augmentait toutefois pas au fil des générations successives.

Les analyses de plusieurs marques épigénétiques dans les embryons précoces ont également révélé des profils globalement similaires chez les nouveaux clones et ceux de la 51e génération. La TSA restait utile : le taux de réussite des naissances à la 51e génération était de 5,4 % avec le traitement, contre 1,6 % sans traitement.

Les télomères, les séquences d’ADN protectrices situées aux extrémités des chromosomes, constituaient une autre explication possible. Les analyses de séquençage réalisées par la suite n’ont guère confirmé un raccourcissement important au fil des générations étudiées. Pris ensemble, ces tests orientaient vers l’accumulation croissante de mutations dans la séquence d’ADN et la structure des chromosomes.

Des souris apparemment en bonne santé avaient moins de petits

Les accouplements ordinaires ont révélé une baisse de la capacité de reproduction qui n’était pas évidente à l’apparence des souris. Les femelles de la 20e génération ont eu en moyenne 9,9 petits par portée lorsqu’elles étaient accouplées à des mâles ordinaires, un chiffre proche des 10,3 enregistrés dans le groupe témoin.

La taille moyenne des portées est ensuite tombée à 2,8 petits à la 50e génération et à 2,2 à la 55e. Ce dernier chiffre était inférieur d’environ 79 % à la moyenne du groupe témoin, calculée à partir de 2,2 contre 10,3 petits.

Le nombre d’ovules recueillis après stimulation hormonale n’a pas diminué au fil des générations clonées. Les chercheurs ont donc examiné ce qui arrivait aux ovules après leur activation ou leur fécondation.

Lorsque des ovules étaient fécondés en laboratoire avec le sperme de mâles ordinaires, 97,6 % des embryons témoins atteignaient le stade blastocyste, un stade précoce qui précède l’implantation. Cette proportion était de 39,7 % pour les ovules de clones de la 25e génération et de 20,3 % pour ceux de clones de la 53e génération.

Les expériences menées avec des ovules de la 56e génération ont révélé des problèmes touchant à la fois le noyau et le cytoplasme, la matière qui l’entoure. Le remplacement de l’un ou de l’autre par son équivalent provenant d’un ovule témoin aboutissait malgré tout à des taux de développement très faibles. Les deux composantes de l’ovule semblaient altérées.

La reproduction sexuée a rétabli une partie de la fertilité

Certains descendants de clones tardifs ont survécu et se sont reproduits plus efficacement. Alors que les femelles clonées de la 55e génération avaient en moyenne 2,2 petits par portée, leurs descendants ont ensuite eu des portées de 7,0 petits en moyenne, soit plus de trois fois plus.

Chez ces petits-enfants, les placentas étaient également proches, par leur taille, de ceux issus d’embryons fécondés, et non hypertrophiés comme c’est généralement le cas chez les souris clonées.

La reproduction sexuée redistribue le matériel génétique lors de la formation des ovules et des spermatozoïdes, puis le combine avec l’ADN d’un autre parent au moment de la fécondation. Une copie fonctionnelle d’un gène héritée d’un parent peut parfois compenser une copie altérée héritée de l’autre. Les embryons présentant de graves problèmes génétiques peuvent cesser de se développer, tandis que ceux dotés de combinaisons viables survivent.

Les descendants ont tout de même hérité de mutations des femelles clonées. Le séquençage du génome a révélé des variants chez les descendants et les petits-enfants, dont l’échange entre les chromosomes 7 et 9. Les chercheurs ont avancé que les deux chromosomes altérés avaient été hérités ensemble, préservant ainsi l’équilibre de l’échange.

L’amélioration de la taille des portées indique donc un rétablissement partiel de la capacité de reproduction grâce à la reproduction sexuée. Les descendants ont pu mieux se reproduire tout en conservant certaines des mutations accumulées pendant le clonage.

Ce que cela signifie pour la conservation et l’élevage

Le clonage intéresse les spécialistes de la conservation, car des cellules conservées peuvent préserver le matériel génétique d’animaux morts ou incapables de se reproduire. Dans l’élevage, il offre un moyen de reproduire des animaux présentant des caractéristiques recherchées. L’expérience montre que ces usages nécessitent de tenir compte de l’état de l’ADN des donneurs et de la santé reproductive de leurs descendants.

Le résultat concerne des clonages répétés au sein d’une longue chaîne de donneurs successifs. Les 58 générations constituent le terme de cette lignée de souris dans les conditions expérimentales de l’étude ; on ignore combien de générations seraient possibles dans d’autres lignées ou chez d’autres espèces de mammifères.

Katarzyna Malin, endocrinologue du développement à l’université de Californie à Davis, qui n’a pas participé à l’étude, a déclaré que ces résultats plaidaient en faveur d’une conservation visant à empêcher les espèces d’atteindre une situation de crise, plutôt que de compter sur le clonage pour les sauver après coup.

Ben Novak, de l’organisation de conservation Revive & Restore, a souligné l’importance des mutations qui s’accumulent dans les tissus du corps au cours de la vie d’un animal. Une cellule donneuse porte ses propres mutations de l’ADN, ce qui compte lorsque cette cellule devient le point de départ d’un autre animal.

L’étude met en évidence deux enseignements pratiques. Le clonage peut préserver l’accès au matériel génétique d’un animal pendant de nombreuses générations, mais la santé des descendants dépend aussi de l’évolution de cet ADN au fil du temps. Dans cette expérience, l’accouplement ordinaire a permis à certains descendants de retrouver une partie de leur fertilité alors que la lignée clonée touchait à sa fin.

À retenir

• Les chercheurs ont réalisé 30 947 tentatives de transfert nucléaire et produit plus de 1 200 souris à partir d’une femelle initiale par clonages successifs.
• Le taux de réussite des naissances a atteint un pic de 15,5 % à la 26e génération, puis a chuté à 0,6 % vers la fin de l’expérience.
• Les cinq souris de la 58e génération sont mortes le lendemain de leur naissance, mettant fin à la lignée en 2025.
• La lignée clonée a accumulé environ trois fois plus de mutations touchant une seule lettre de l’ADN par génération que les lignées témoins maintenues par accouplement entre frères et sœurs.
• Des mutations délétères de l’ADN et d’importantes altérations chromosomiques se sont accumulées, tandis que les anomalies épigénétiques mesurées ne s’aggravaient pas progressivement.
• La reproduction sexuée a amélioré la fertilité de certains descendants, même si des mutations héritées subsistaient.